实验目的1. 了解荧光显微镜的基本原理;2. 掌握荧光显微镜的基本结构和使用注意事项; 自发性荧光物质 神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧 光。 肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A呈 绿色荧光。 某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质 (儿茶酚胺、5-羟色胺、组胺等)在甲醛作用下 呈不同颜色的荧光。 组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的 荧光。 嗜中性粒细胞中脱氢酶辅酶呈现一定的荧光。 荧光素 激发波长 发射波长DAPI 372 456AMC A 350 450Hoe ch st 33258 365 465FITC 490 520Acri di n e O ran ge 490 590Acri di n e Ye l l ow 470 550C Y3 552 565TRITC 541 572Propi di u m Iodi de 530 615 荧光显微镜的优点和用途优点: 检出能力高 对细胞的刺激小 能进行多重染色用途: 物体构造的观察 荧光的有无、色调比较进行物质判别 发荧光量的测定对物质定性、定量分析实验原理实验原理荧光显微镜的光路及主要部件 光源 激发光挡片 激发滤色镜 分色镜Microscopes with an upright-style frame arecapable of producing fluorescenceillumination either through episcopic ordiascopic optical pathways although thelatter is rarely used today. Epi-illuminatorsusually consist of a mercury or xenonlamphouse coupled to a vertical illuminatorthat is positioned above the main frame in aseparate assembly. The microscopenosepiece and transmitted light componentsdiascopic illuminator condenser fielddiaphragm filters etc. are built into the mainframe while fluorescence components arehoused in the vertical illuminator. Theseilluminators often contain a revolving orsliding turret that houses four to six cubesthat contain a mixture of interference filtersincluding a barrier filter dichroic mirror andan excitation filter. As illustrated above lightemitted from the lamp positioned in theepiscopic lamphouse passes through acollector lens and then the field and aperturediaphragms before entering the firstinterference filter in the cube set theemission filter. This light is then directedthrough the objective and onto the specimenby a special dichroic mirror that reflectscertain wavelengths while passing others.Secondary fluorescence emitted byfluorophores residing in the specimen travelsback through the objective and the dichroicmirror before passing through a barrier filterand into the microscope eyepieces or camerasystem. 激发光源 高压汞灯拥有313 337 365 405 436 546 and 577 纳米的峰值谱。高压 Xenon灯有连续的可见光光 谱范围 光源强度比较平均。 汞灯光谱 激发滤色块 具有多套激发滤色块:激发滤色镜(Excitation Filter)，分 光镜(Dichromatic Mirror)，发射滤色镜(Emission Filter)。 激发滤色块 六孔激发块转盘多用途型BX-RFA适合多种科研要求及通用型BX-URA2。可同时使用6种荧光激发块， “轻拨式”激发块转换功能，使不同荧光激发之间的迅速转换非常方便，并可消除震动，有利于复染样品的荧光观察。激发块标识在暗室环境中发光，在暗室中也能很容易地选择需要的荧光激发块。另外，根据需要还可以选择6孔滤色片滑块U-RSL6/U-RSL6EM安放激发滤色片和发射滤色片进行荧光观察。BX51 在镜基上装有3个滤色片(ND6，ND25，LBD)，另外，还可以选装第四个。镜基侧面的拉杆可以很容易地插入/取出滤色镜。Specimen color fading canbe delayed by reducing theexcitation light intensity withND filters. Use the ND filtersas far as they do not hinderobservations.Insert the ND filters U-25ND6 and/or U-25ND25with the marked side facingtoward the observer.1、 该镜可作为明视场显微镜使用，也可作为荧光显微镜使用，根据需要，做相应的附件连接，开启相应的电源。禁止乱调设置，以免影响他人正常使用。2、 作为明视场显微镜使用;A、接通电源后，打开显微镜底座前的电源开关，按光亮需要调节底座右侧的滑竿。B、根据需要，调节底座光栅和聚光器光栅及其高度，可获得最佳的图象效果。C、需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。3、 作为荧光显微镜使用;A、先关闭荧光通道，再打开荧光激发器电源，等待15分钟。B、等待期间，打开显微镜光源，找到需要观察的样品，选用合适的物镜，调整焦距。C、关闭显微镜光源，打开荧光通道。D、需要图片，要把镜体上的相应拉杆拉到绿线位子。按下相应附件上的照相按扭。细胞核与细胞质DNA的直接荧光染色根(显示 叶片叶绿体) 线粒体GFP转基因拟南芥注意事项激发光挡片的使用----减少淬灭 注意事项 荧光的淬灭与激发光的照射时间成正比，因此应尽 量减少观察时间外激发光对样品的照射。激发光挡 片可以部分或完全阻断激发光光路。在正式观察样 品之前，激发光光路应该处于完全阻断状态。否 则，在我们将样品放到载物台上，移动样品台将样 品调整到物镜位置，找到要观察的细胞并进行调焦 的过程中，样品上的荧光可能已经发生了相当程度 的淬灭。为了避免观察前不必要的淬灭，上述一系 列操作需要在透射光源下进行。 当眼睛离开物镜进行记录或将显微镜交给合作实验 者观察时，要随手阻断激发光光路。实践结果表 明，熟练、规范和合理的观察操作可以将样品淬灭 对观察和记录造成的影响降低到最小限度。 荧光信号的淬灭还与激发光的强度成正比。因此， 在可以观察到荧光信号的情况下，应该尽量降低激 发光的强度。这样做还有利于降低背景。